NESPECIFICKÝ BIOMONITORING PŘÍTOMNOSTI TOXICKÝCH LÁTEK VE VODĚ POMOCÍ PERLOOČEK

Šárka VESELÁ, Vlastimil ONDRUŠKA

Nespecifický biomonitoring toxických látek a jedů v pitné vodě pro mírové a polní využití

NESPECIFICKÝ BIOMONITORING PŘÍTOMNOSTI TOXICKÝCH LÁTEK VE VODĚ POMOCÍ PERLOOČEK

Šárka VESELÁ, Vlastimil ONDRUŠKA

Projekt obranného výzkumu „BIOMONITORING – Nespecifický biomonitoring toxických látek a jedů v pitné vodě pro mírové a polní využití“ byl řešen od roku 2003 do roku 2005 ve Výzkumném a vývojovém středisku Hostivice (VVStř Hostivice). Předmětem řešení tohoto projektu bylo prakticky ověřit možnost využití drobných vodních korýšů – perlooček [16] pro nespecifický biomonitoring vody v polních podmínkách a stanovit optimální druh, případně více druhů, které by bylo možné použít jako biologickou součást zařízení pro průběžný nespecifický biomonitoring vody v polních podmínkách, o jehož vývoji se do budoucna uvažuje. Cílem výzkumu bylo zanalyzovat možnosti využití různých druhů perlooček v závislosti na jednoduchosti jejich chovu a manipulace s nimi, citlivosti k jednotlivým toxikantům reprezentujícím vybrané skupiny látek, odezvy a snadnosti odečítání výsledků [14].
V průběhu řešení projektu bylo zakoupeno základní laboratorní vybavení a provedeny rešeršní a studijní činnosti odborné literatury týkající se tématu projektu. Aby mohly být provedeny plánované pokusy, bylo nutno nejprve založit laboratorní chovy a vypracovat metodiku dlouhodobého chovu perlooček a též metodiku přípravy krmiva.
Vzhledem k tomu, že existuje velké množství druhů perlooček [4] byl proveden nejprve jejich teoretický předvýběr a poté byly shromážděny vybrané druhy (Tab. č. 1). Ty byly většinou získány darem z již zavedených laboratorních chovů. Pokud to bylo nutné, byla vyhledána lokalita, kde se potřebné druhy vyskytovaly, a byl proveden jejich odlov.
Při vývoji metodiky dlouhodobého laboratorního chovu byly provedeny pokusy s cílem vybrat z výše uvedených druhů ty, které jsou nejjednodušeji chovatelné (manipulace, náročnost na kultivační médium a potravu, tolerance ke vlivům okolního prostředí, apod.) v podmínkách s minimálním laboratorním vybavením [17]. Postup a výsledky těchto pokusů jsou podrobně popsány ve článku „Výběr vhodných druhů a kmenů drobných vodních korýšů pro využití v AČR“ [19]. S přihlédnutím k možnému dalšímu využití perlooček jako testovacích organismů bylo nutno otestovat možnosti chovu nezávisle na okolních zdrojích, tj. především na chovném médiu získaném odběrem z vodních těles ve volné přírodě. Proto byl proveden pokus, jehož cílem bylo ověřit možnost využití média ISO [7] jako uměle připraveného chovného média pro laboratorní chov perlooček. Tento experiment je podrobně popsán v článku „Laboratorně připravené médium pro chov perlooček“ [18]. Na základě vyhodnocení výsledků s chovy jednotlivých druhů perlooček, zanalyzování aktuálních možností a požadavků, bylo množství druhů a klonů pro další pokusy zúženo na čtyři: PU3 (druh Daphnia pulicaria), TG100 (druh Daphnia galeata), PXCL (druh Daphnia pulex), VSCHT (druh Daphnia magna), které mohou být dle aktuální situace a potřeby dále doplněny.

Název klonu	Druh	V laboratoři chován od r.	Původ	Druh potvrzen genetickou analýzou
TG100	Daphnia galeata	21. 7. 1992	jezero Tijeukemeer, Nizozemí [12]	Ano
TC33	Daphnia cucullata	28. 10. 1992	jezero Tijeukemeer, Nizozemí [12]	Ano
CL2	Daphnia cucullata	Datum narození matky 16. 8. 1997	laboratorní křížení, NIOO-Cl[1],Nizozemí	Ano
DL3	Daphnia lumholtzi	3. 2003	Thajsko	neprovedeno
PU3	Daphnia pulicaria		Nizozemí	neprovedeno
SP2	Daphnia pulicaria	23. 11. 1998	Blomsterstrand, Špicberky	Ano
PXCL	Daphnia pulex	13. 8. 1998	jezírkoVijver, Nizozemí	Ano
P	Daphnia magna	29. 9. 2003	Prosek, Praha, ČR	neprovedeno
VSCHT	Daphnia magna	1996	VŠCHT, ÚCHOP[2], ČR
HK	Daphnia magna		Firma EMPLA, ČR (klon a sensu Baird et al [1]
CERIO	Ceriodaphnia sp.	2. 7. 2003	Hostivice, ČR	neprovedeno

Tab. č. 1          Druhy a klony perlooček získané pro laboratorní chov a používané v pokusech uvedených v této práci

Souběžně s experimenty s chovy perlooček probíhal vývoj aparatury pro kultivaci řas, jednalo se o druh Scenedesmus acutus. Tato řasa byla používána jako potrava pro perloočky. Vývoj aparatury spolu s nákresy jsou popsány v článku „Vývoj kultivační aparatury pro kultivaci řas v AČR“ [20]. Bylo vybráno vhodné kultivační médium a testován nejoptimálnější způsob jeho přípravy, což je popsáno v článku „Modifikace přípravy zásobních roztoků média BB a jejich vliv na růst řasové kultury“ [21].
Možnost chovu vybraných druhů perlooček a dlouhodobá kultivace řas byly též úspěšně testovány v podmínkách modelového kontejnerového pracoviště, které má VVStř Hostivice k dispozici.
Hlavním cílem projektu bylo zjistit citlivosti perlooček k  toxikantům reprezentujícím vybrané skupiny látek. Pro provedení těchto pokusů byla využita metodika ekotoxikologických testů, jež je popsaná v normě ČSN EN ISO 6341 Jakost vod – Zkouška inhibice pohyblivosti Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) – Zkouška akutní toxicity [7]. Ekotoxikologické testy jsou běžným nástrojem používaným v akvatické ekotoxikologii, kde slouží především k charakterizaci rizika, jež testované látky nebo jejich směsi představují pro vodní ekosystémy a zároveň popisují, jak se jejich působení může projevit a jaký bude jejich osud. Principem testů je stanovení procentuálního počtu jedinců u kterých se po uplynutí zvolené doby projeví sledovaný efekt (např. úmrtí, nehybnost) a to vše při několika koncentracích testované látky. Cílem testů je určit tzv. hodnotu „efektivní koncentrace – EC50“. Je to počáteční hodnota koncentrace testované látky v médiu, při které se sledovaný efekt projeví u 50% organismů použitých v daném testu [11]. Efektem zvoleným pro pokusy byla imobilizace zvířat. Jako imobilizované jsou považovány všechny perloočky, které se jako výsledek toxického působení testované látky nejsou schopny rozplavat během 15 vteřin po mírném zamíchání roztoku v kádince.
Při řešení projektu byla tato metodika využita jako základní nástroj pro zjištění citlivosti perlooček vůči vybraným látkám. Zároveň se stanovováním hodnot EC50 probíhalo i vizuální sledování chování perlooček v jednotlivých koncentracích a při působení testovaných látek. Pro testování byly zvoleny dvě skupiny látek – ireversibilní inhibitor acetylcholinesterázy (vybraná byla látka tabun) a reaktivátory acetylcholinesterázy (oximy). V rámci skupiny reaktivátory acetylcholinesterázy bylo použito více látek, aby byla otestována citlivost perlooček vůči látkám majícím podobný mechanismus účinku, ale odlišnou chemickou strukturu.
Tabun (GA, O-ethyl-N,N-dimethylamidokyanofosfát) je první uměle vytvořená nervově paralytická bojová otravná látka (1936, IG Farben, Německo) [13]. Hlavní toxický efekt je u savců způsoben jejich interakcí s enzymem acetylcholinesterázou (AChE, EC 3.1.1.7), ireversibilní fosorylací jeho aktivního místa a následnou inhibicí. To způsobí akumulaci acetylcholinu na synapsích v periferním i centrálním cholinergním nervovém systému a na nervosvalovém spojení, což vede k rozvrácení jejich normální funkce [2,3]. Při biochemickém rozboru homogenátů získaných z těl perlooček rodu Daphnia magna bylo zjištěno, že perloočky mají cholinergní nervový systém [8,9]. Jak bylo předpokládáno, tabun byl pro perloočky velmi toxický i při krátké expoziční době a jeho toxicita se s časem zvyšovala. Zjištěná akutní toxicita tabunu vyjádřená hodnotou EC50 (doba expozice byla od 15 do 60 minut) pro Daphnia magna byla v rozmezí 85,03 μg.l-1 (při expozici 15 minut) do 21,90 μg.l-1 (při expozici 60 minut) [22].
Sloučeniny typu oximů (testovány byly: pralidoxim, trimedoxim, obidoxim, HI-6, K027, K033 a K048) se používají pro reaktivaci organofosfáty inhibované acetylcholineasterázy. Mechanismus jejich účinku spočívá v obnovení normálního přenosu cholinergního nervového vzruchu reaktivací inhibované AChE a to odtržením inhibitoru (organofosfát) navázaného na specifické vazebné místo AChE a vytvořením komplexu oxim - organofosfát [2]. Na základě získaných výsledků jsou oximy toxické pro juvenilní jedince perloočky Daphnia magna již při poměrně nízké koncentraci (jedná se o miligramy na litr média u pralidoximu a desítky respektive stovky miligramů na litr u ostatních testovaných oximů). Při sledování toxicity v čase bylo zjištěno, že stoupá s dobou expozice [23].
Jak bylo zjištěno, perloočky jsou velice citlivé na přítomnost toxikantů v médiu. Různé změny v chování byly pozorovány v závislosti na typu použité látky, její toxicitě a formě toxického účinku. Při testování akutní toxicity nervově paralytické látky tabun bylo možno vizuálně pozorovat změnu v charakteru a směru plavání perlooček přibližně po pěti minutách, u oximů byly pozorovány změny v chování po několika hodinách.
Perloočky jsou oblíbení a často používaní živočichové v normativních testech v oblasti akvatické ekotoxikologie. Nejčastěji se pracuje s „velmi velkým“ druhem Daphnia magna, mimo něj se občas používají dva „velké druhy“ perlooček, Daphnia pulicaria a Daphnia pulex [6]. Přestože existuje mnoho dalších druhů [4], tyto se v ekotoxikologických testech neužívají.
Nejčastějšími důvody pro zvolení druhu D. magna jsou jeho velikost a relativně největší množství neonát v jedné snůšce v porovnání s ostatními druhy [5]. Přesto, že zvířata určená pro laboratorní testy jsou většinou chovaná za standardizovaných podmínek, přirozený habitat a „life-history“ strategie se mohou u různých druhů perlooček odlišovat [10].
V dalším experimentu bylo proto cílem otestovat citlivost čtyř již dříve vybraných odlišně velkých druhů perlooček vůči modelovému toxikantu (zinku). Jak bylo očekáváno, toxicita zinku klesala se vzrůstající velikostí testovaných druhů. Nejmenší druh Daphnia galeata (hodnota EC50 při 24 hodinové expozici byla 999 μg.l-1) byl vůči zinku nejcitlivější a největší druh Daphnia magna nejméně citlivý (hodnota EC50 při 24 hodinové expozici byla 4461 μg.l-1). Při dalších testech je proto nutné vzít v úvahu možné rozdíly v citlivosti odlišných druhů perlooček a v ideálním případě provádět výzkum současně na nejméně a nejvíce citlivém druhu.
Je možno shrnout, že perloočky jsou organismy, které lze s úspěchem využít pro detekci toxického znečištění vody, a to i při znečištění neznámým toxikantem (nebo jejich směsí), či při znečištění toxickými produkty jejich rozkladu. Po dopracování metodik sledování a vyhodnocení je možné je využít jako biologickou součást zařízení pro průběžný nespecifický biomonitoring vody v polních podmínkách. Vzhledem k úspěchům projektu BIOMONITORING se počítá s jeho pokračováním. Záměrem výzkumu tentokrát bude porovnat reakce perlooček na působení vybraných potenciálně zneužitelných toxických látek odlišného toxického účinku pomocí snímání a analýzy pohybu perlooček. Na základě získaných poznatků bude možno již přistoupit k vývoji zařízení pro průběžný nespecifický biomonitoring vody.

Literatura:
[1] BAIRD, D.J. - BARBER, I. - BRADLEY, M. - CALOW, P. - SOARES, A.M.V.M. 1989. The Daphnia bioassay: a critique. Hydrobiologia 188/189, p. 403 – 406.
[2] BAJGAR, J., 2004a. Organophosphates nerve agents poisoning: mechanism of action, diagnosis, prophylaxis and treatment. Adv. Clin. Chem., 38, p. 151 - 216.
[3] BAJGAR, J., 2004b. Nervově paralytické látky. In Patočka, J. (ed.), Vojenská toxikologie. Grada Publishing, Praha, p. 30 – 44.
[4] BENZIE, J.A.H., 2005. Cladocera: The genus Daphnia (including Daphniopsis). Guides to the identification of the microinvertebrates of the continental waters of the world vol. 21. Kenobi Productions, Ghent, Belgium.
[5] CANTON, J.H. - ADEMA, D.M.M., 1978. Reproducibility of short-term and reproduction toxicity experiments with Daphnia magna and comparison of the sensitivity of Daphnia magna with Daphnia pulex and Daphnia cucullata in short term experiments. Hydrobiologia, 59, p. 135 - 140.
[6] COONEY, J.D., 2003. Freshwater tests. In Rand GM. (ed.), Fundamentals of aquatic toxicology. Tailor & Francis, New York, p. 71 - 102.
[7] ČSN EN ISO 6341, 1997, 1999, 2000. Jakost vod – Zkouška inhibice pohyblivosti Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) – Zkouška akutní toxicity. Oprava 1, oprava 2, ČNI, Praha.
[8] DIAMANTINO, T.C. - ALMEIDA, E., - SOARES, A.M.V.M. - GUILHERMINO, L., 2003. Characterization of cholinesterases from Daphnia magna Straus and their inhibition by zinc. Bull. Environ. Contam. Toxicol., 71, p. 219 - 225.
[9] GUILHERMINO, L. - LOPES, M.C. - CARVALHO, P. - SOARES, A.M.V.M., 1996. Acetylcholinesterase activity in juveniles of Daphnia magna Straus. Bull. Environ. Contam. Toxicol., 57, p. 979 -985.
[10] KOIVISTO, S., 1995. Is Daphnia magna an ecologically representative zooplankton species in toxicity tests? Environ. Pollut., 90, p. 263 - 267.
[11] NEWMAN, C., 1995. Quantitative methods in aquatic toxicology. Lewis Publishers, Florida.
[12] REPKA, S. - VESELÁ, Š. - WEBER, A. - SCHWENK, K., 1999. Plasticity in filtering screens of Daphnia cucullata x galeata hybrids and parental species at two food concentrations. Oecologia, 120, p. 485 - 491.
[13] REUTTER, S., 1999. Hazards of chemical weapons release during war: New perspectives. Environ. Health. Perspect., 107, p. 985 – 990.
[14] VESELÁ, Š., 2003a. Využití drobných vodních korýšů pro detekování toxického znečištění vody. Zprav. voj. farmac., 13 (4), s. 18 – 23.
[15] VESELÁ, Š., 2003b. Jak se „dělá věda“ v zahraničí. Zprav. voj. farmac., 13 (3), s. 13 – 17.
[16] VESELÁ, Š., 2004a. Co víme (a nevíme) o perloočkách. Perloočky v ekotoxikologii. In Kočí, V., Halousková, O., eds., Ekotoxikologické biotesty IV, 15.-17. září 2004, Chrudim, Vodní zdroje Ekomonitor, s. 18 - 25.
[17] VESELÁ, Š., 2004b. Jak úspěšně chovat perloočky. In Kočí, V., Halousková, O., eds., Ekotoxikologické biotesty IV, 15.-17. září 2004, Chrudim, Vodní zdroje Ekomonitor, s. 30 -39.
[18] VESELÁ, Š., 2004c. Laboratorně připravené médium pro chov perlooček v AČR. Zprav. voj. farmac., 14 (2), s. 12 - 16.
[19] VESELÁ, Š., 2004d. Výběr vhodných druhů a kmenů drobných vodních korýšů pro využití v AČR. Zprav. voj. farmac., 14 (4), s. 14 – 19.
[20] VESELÁ, Š. - ONDRUŠKA, V., 2004. Vývoj kultivační aparatury pro kultivaci řas v AČR. Zprav. voj. farmac., 14 (3), s. 26 - 30.
[21] VESELÁ, Š. - TÁBORSKÁ, K. - ONDRUŠKA, V., 2005a. Modifikace přípravy zásobních roztoků média BB a její vliv na růst řasové kultury. Zprav. voj. farmac., 15 (1), s. 3 - 7.
[22] VESELÁ, Š. - KUČA, K. - JUN, D. 2005b. Sensitivity of Daphnia magna Straus to tabun and its degradation products. Task Group on Prophylaxis and Therapy Against Chemical Agents (TG-004) Meeting, 23 – 26 May 2005, Hradec Králové, Collection of abstracts, p. 70.
[23] VESELÁ, Š. - KUČA, K. - JUN, D. - PATOČKA, J. 2005c. Might Daphnids be new experiemntal animals in military toxicology? Task Group on Prophylaxis and Therapy Against Chemical Agents(TG-004) Meeting, 23 – 26 May 2005, Hradec Králové, Fulltext Proceeding.